Ветеринарная лаборатория «Зайцев+» разработала метод выявления микобактерий птиц методом ПЦР.
Термин «микобактериоз» охватывает различные формы проявления инфекционных заболеваний птиц, вызываемых бактериями рода Mycobacterium.
Микобактериоз — хроническое, обычно системное, заболевание. Более 35 видов рода Mycobacterium могут вызывать микобактериоз у птиц (Dahlhausen B. Diagnosis of mycobacterial infections in the exotic pet patient with emphasis on birds. Vet Clin Exot Anim 15, 2012, 71–83).
Одно заболевание — множество возбудителей
Mycobacterium avium subsp. avium и M. genavense являются наиболее распространенными возбудителями туберкулеза у домашних птиц. M. genavense часто встречается у попугаев домашнего содержания, тогда как M. avium subsp. avium в основном поражает диких птиц, содержащихся в вольерах. Микроорганизмы M. tuberculosis, M. bovis, M. intracellularae, M. gordonae, M. simiae, M. intermedium, M. peregrinum, M. terrae, M. avium subsp. paratuberculosis, M. tributes, M. fortuitum, M. diernhoferi, M. chelonae, M. smegmatis, M. flavescens, M. scrofulaceum, M. celatum, M. nonchromogenicum и M. marinum также имеют ассоциированную с микобактериозами этиологию (Samanta I., Bandyopadhyay S. Pet Bird Diseases and Care, 2017, 13).
Сложности диагностики
При осмотре птицы на приеме можно установить предварительный диагноз «микобактериоз» на основе сбора данных анамнеза, клинических признаков, гематологических и серологических анализов и других дополнительных тестов. Предварительный диагноз также можно установить при исследовании клинических образцов, окрашенных по методу Циля–Нильсена.
Микобактерии — неспорообразующие, неподвижные бациллы. Сложная, богатая липидами клеточная стенка и толстый слой миколовой кислоты делают микроорганизмы кислотоустойчивыми. При использовании метода окраски по Цилю–Нильсену микобактерии приобретают розово-красный цвет и представляют собой палочковидные бактерии; при этом M. Avium может выглядеть почти кокковидным или иметь вид длинных четких стержней. В зависимости от хронического течения и тяжести инфекции микобактерии могут быть обнаружены либо внутриклеточно (внутри тканевых макрофагов), либо внеклеточно (Tell L.A., Woods L., Cromie R.L. Mycobacteriosis in birds. Rev Sci Tech. 2001, Apr; 20(1), 180–203).
Цитологическое исследование является простым, недорогим и дает быстрые результаты, но микроорганизмы могут быть легко пропущены, если количество микобактерий невелико. Предел обнаружения для цитологических образцов оценивается в 10 000 бацилл/мл. «Мусор» в образце может давать неспецифическую окраску и дополнительно затруднить цитологическую идентификацию этих организмов, поэтому образцы помета, будь то от клинически здоровых птиц, выделяющих микобактерии, или от птиц, страдающих диареей, могут быть ложноотрицательными или ложноположительными при цитологическом исследовании.
Внимание! Микобактериоз нельзя исключать на основании отрицательного цитологического исследования помета. И наоборот, диагноз микобактериоза не должен основываться на наличии кислотоустойчивых организмов в помете, так как также могут быть обнаружены непатогенные микобактерии или образец может быть контаминирован при сборе материала из вольера.
Таким образом, положительный результат микроскопического исследования клинических образцов по методу Циля–Нильсена должен быть подтвержден либо культуральным исследованием, либо более чувствительными молекулярными методами (Tell L.A., Woods L., Cromie R.L. Mycobacteriosis in birds. Rev Sci Tech. 2001, Apr; 20(1), 180–203).
Посев является золотым стандартом для подтверждения диагноза микобактериальной инфекции у птиц, хотя этот метод также имеет несколько практических ограничений. Микобактерии, патогенные для птиц, представляют собой медленно растущие организмы, время репликации которых составляет не менее 15 часов. Для появления видимых колоний на культуральной среде может потребоваться от двух до четырех недель, а некоторым штаммам M. avium требуется до шести месяцев, прежде чем колонии можно будет идентифицировать. Микобактерии требуют специальной питательной среды и имеют особые требования к субстрату. У птицы могут быть типичные для микобактериоза поражения с выявленными микроскопически кислотоустойчивыми бактериями, но культурально они не растут, что дает ложноотрицательный результат. Поэтому микробиологическое исследование должна выполнять высококвалифицированная лаборатория, которая специализируется на диагностике микобактериозов (Tell L.A., Woods L., Cromie R.L. Mycobacteriosis in birds. Rev Sci Tech. 2001, Apr; 20(1), 180–203).
Оперативный диагноз
С учетом трудностей культуральной диагностики большое значение приобрели методы молекулярной диагностики, основанные на выявлении геномного материала микобактерий в клинических образцах. Наиболее широкое применение получил метод ПЦР, преимуществом которого является быстрота выполнения и высокая специфичность.
Для выявления микобактерий методом ПЦР подходит различный клинический материал: респираторные и клоакальные смывы, помет, патологический материал. Хотя метод ПЦР и обладает высокой чувствительностью, важным фактором является правильность взятия клинического материала с места локализации патологического процесса, в противном случае можно получить ложноотрицательные результаты (Dahlhausen B. at al. Diagnosis of Mycobacterial Infections in the Exotic Pet Patient with Emphasis on Birds. Vet Clin Exot Anim, 15, 2012).
Поскольку у птиц можно обнаружить многие разновидности микобактерий, а в одном анализе методом ПЦР невозможно выявить все потенциальные виды, то в этом случае важную роль играют методы, которые позволяют быстро и точно определить конкретный вид микобактерий.
Одним из таких методов является секвенирование генома возбудителя. При секвенировании анализируются длины участков генома, достаточные для точной идентификации конкретного генотипа микобактерии.
В лаборатории «Зайцев+» был разработан метод выявления микобактерий птиц методом ПЦР, в котором на первом этапе определяются микобактерии как “spp.” (видовая принадлежность к микобактериям) следующих видов: M. avium, M. bovis, M. tuberculosis, M. genavense, M. intracellularae. На втором этапе, после выявления микобактерии как “spp.”, мы предлагаем секвенирование для установления точного вида микобактерий.
В 2022 году в нашей лаборатории было исследовано 285 клинических образцов на микобактериозы птиц, из которых 14 было положительных. При секвенировании были дифференцированы следующие генотипы: M. avium — 9, M. genavense — 2, M. intracellularae — 2, M. tuberculosis — 1.
